丛志奇、冯银刚等揭示双功能分子协同P450酶催化系统的结构基础与过氧化物酶新功能

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细胞色素P450酶是一类含血红素的单加氧酶，在药物代谢、异生物质解毒和类固醇生物合成中发挥重要作用，同时因其具有多功能生物氧化催化、合成的应用潜力而备受关注。针对绝大多数天然P450单加氧酶催化功能的实现高度依赖辅酶NAD(P)H和负责电子传递的还原伴侣蛋白的关键科学问题，青岛能源所丛志奇研究员带领的单碳酶催化研究组成功构建了双功能小分子（DFSM）协同P450酶催化系统，能够有效利用过氧化氢作为末端氧化剂，解除P450酶对辅酶体系依赖的同时极大提高P450BM3对苯乙烯、乙苯、和苯甲硫醚等非天然底物的催化活性，为基于P450酶的生物催化剂开发提供了新的思路（Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 7628-7633. Very important paper, Highlighted by Chemistry Views）。
　　最近，单碳酶催化研究组与代谢物组学研究组冯银刚研究员团队合作，巧妙地利用羟胺代替过氧化氢，成功制备并解析了蛋白-羟胺-双功能小分子三元复合物的高分辨率晶体结构，建立了双功能小分子协同P450活化过氧化氢的预反应态模型，为解析其分子机制提供了结构基础（图1）；进而与厦门大学王斌举教授团队合作，通过理论计算模拟，进一步阐明了双功能小分子介入活性中心氢键网络、使过氧化氢以较低能垒的异裂方式被活化，有利于反应活性物种生成，从而大幅提高了P450酶催化活力的反应机理（ACS Catal. 2021, 11, 8774-8785）。

　　图1 “双功能分子-P450-羟胺”三元复合物的晶体结构

　　近年来，单碳酶催化研究组先后报道了DFSM协同P450酶催化系统高效的过加氧酶（peroxygenase）功能，比如催化气态烷烃分子的选择羟化（ACS Catal. 2019, 9, 7350-7355）、木质素单体芳醚的脱甲基化（Catal. Sci. Technol. 2020, 10, 1219-1223. Inside front cover）、以及苯乙烯的高度R-对映选择性环氧化（Chem. Sci. 2021, 12, 6307-6314. Back cover, highlighted in “hot off the press” in Nat. Prod. Rep. 2021, 38, 1053）。为拓展DFSM协同P450酶系统的催化多功能性，研究人员利用酶化学机制指导的蛋白质工程策略将该系统由过加氧酶转换为过氧化物酶（peroxidase）模式，开发了DFSM协同P450酶催化系统的过氧化物酶新功能（ACS Catal. 2021, 11, 8449-8455）。

　　图2 DFSM促进的P450过加氧酶至过氧化物酶的功能转换

　　过氧化物酶是一类重要的氧化还原酶，在生物催化、生物传感器和生物医学中具有广泛的应用。在细胞色素P450酶研究中，与单加氧酶和过加氧酶催化功能相比，对其过氧化物酶活性的研究仍然较少。研究人员基于对DFSM协同P450酶系统中三种可能催化途径的机制分析，提出了氧化还原敏感残基的竞争性氧化途径可能是阻碍该系统过氧化物酶功能的主要原因的假设，进而通过对不同种类氧化还原敏感残基进行热点筛选和迭代组合突变，成功开发出DFSM协同P450酶系统的过氧化物酶新功能（图2），能够高效催化愈创木酚、2,6-二甲氧基苯酚、邻苯二胺、对苯二胺的一电子氧化反应，催化性能可媲美或超过大多数天然过氧化物酶。与厦门大学王斌举教授团队的模拟计算合作研究表明，DFSM协同P450系统中过氧化物酶活性可能来源于消除氧化还原敏感残基的竞争性氧化或蛋白质工程后底物的重定位。该研究进一步证明了DFSM协同P450酶催化系统的可塑性和在生物催化领域的应用潜力，为发展基于P450酶的生物催化剂提供了新的见解和策略。
　　目前上述两项相关工作均发表于国际催化领域权威杂志ACS Catalysis。厦门大学张璇博士、青岛能源所姜谊平博士、厦门大学陈倩倩为论文一的共同第一作者，厦门大学王斌举教授、青岛能源所丛志奇研究员、冯银刚研究员为共同通讯作者；青岛能源所博士研究生马娜娜和厦门大学房文涵为论文二的共同第一作者，丛志奇研究员、王斌举教授为共同通讯作者。上述工作得到国家自然科学基金，国家重点研发计划，青岛市创新领军人才计划，青岛能源所创新基金以及山东省合成生物技术创新中心等的大力支持。（文/图 丛志奇 马娜娜 姜谊平）


　　附录：
　　1.Zhang, X.+; Jiang, Y. +; Chen, Q. +; Dong, S.; Feng, Y.*; Cong, Z.*; Shaik, S.; Wang, B.* H-Bonding Networks Dictate the Molecular Mechanism of H2O2 Activation by P450. ACS Catalysis 2021, 11, 8774-8785.
　　Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.1c02068
　　2.Ma, N. +; Fang, W. +; Liu, C.; Qin, X.; Wang, X.; Jin, L.; Wang, B.*; Cong, Z.* Switching an Artificial P450 Peroxygenase into Peroxidase via Mechanism-Guided Protein Engineering. ACS Catalysis 2021, 11, 8449-8455.
　　Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.1c02698


      文章来源：青岛能源所
      丛志奇, 博士、研究员、博士生导师，中国科学院青岛生物能源与过程研究所，单碳酶催化研究组组长。于2009年在日本熊本大学获得理学博士学位，随后在日本分子科学研究所和名古屋大学从事博士后研究，参与多项日本文部省基础和重大研究课题。2016年回国工作后主持国家自然科学基金面上项目2项、青岛市创新领军人才计划、青岛能源所十三五期间“一三五”重点培育方向项目等研究课题。以第一和通讯作者在J Am Chem Soc、Angew Chem Int Ed、ACS Catal等国际期刊发表研究论文20多篇。主要研究方向是金属酶的化学机理解析、生物酶催化及其在合成生物技术上的应用。相关研究成果被ChemistryViews、中国科学报、中科院网站、基金委网站等专题报道，并被权威学术杂志多次正面引用和评述。
       冯银刚，1999年毕业于南京大学物理学系生物物理专业，获理学学士学位，2004年毕业于中国科学院生物物理研究所生物化学与分子生物学专业，获理学博士学位，2004-2006在北京大学化学与分子工程学院北京核磁共振中心进行博士后研究工作，2006-2011年在中国科学院生物物理研究所任副研究员,2011年6月在中国科学院青岛生物能源与过程研究所任研究员。长期从事生物大分子核磁共振和蛋白质结构功能研究，目前主要进行能源微生物与能源植物蛋白质的结构、功能和性能改良研究。在SCI刊物上发表研究论文二十余篇，承担国家自然科学基金，北京市自然科学基金等多项研究项目。