《Science Advances》报道陈洪渊、黄硕课题组无电极仿生纳米孔芯片技术

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自然界中广泛存在的物质跨膜输运现象通过介导细胞内外物质交换在分子水平上对诸多生物学过程进行精准调控。其中，无机离子，葡萄糖，核酸，氨基酸及其它细胞代谢物的跨膜输运需要由特定的膜通道蛋白介导完成。这些膜通道蛋白由蛋白质单体或者多聚体于生物膜上自发组装形成跨膜孔道。膜片钳技术可以有效的逐个探究单个膜通道蛋白的生物物理学性质。随着越来越多新型的膜通道蛋白被发现，探究和理解，这些通道的门控动力学性质与输运机制逐步得到了解读。


新兴的单分子纳米孔技术正是建立在膜片钳技术这一基础上的膜通道仿生技术，其基本原理是利用电场力驱动单个分子或离子通过纳米孔引起的皮安级电流变化来进行单分子检测。纳米孔技术应用广阔，可以用于蛋白质分析，金属离子检测，有机小分子识别，纳米粒子表征，单分子化学，单分子质谱以及DNA测序。然而，自1993年首个纳米孔传感概念的展示以来，无论纳米孔技术的仪器形式如何变化，其检测机理完全是来源于依赖膜片钳技术的电信号检测方法。虽然这种方法具有超高的时间分辨率（~10 μs）和电流分辨率（＜0.1 pA），但受限于现有的微电子和微电极加工技术的技术门槛和成本限制，扩大检测通量是该领域的主要瓶颈。现阶段，单分子基因测序是纳米孔传感领域内最重要的应用，同时也伴随着海量的数据采集需求，随着纳米孔测序技术产业化逐步展开，人们对超高通量纳米孔测序（大于100万个孔道）的需求愈发迫切，因此亟待发展一种新型的纳米孔检测模式，以不显著提高检测成本为前提突破现有检测通量的局限。

数十亿年的生物进化过程早以筛选出一系列结构最为精简，运转最为高效的跨膜输运机制。T4噬菌体能专一地吸附在寄主细胞表面的相应受体上, 将头部的DNA通过中空的尾部（直径为2.5～3.5 nm）注入宿主细胞内。金黄色葡萄球菌分泌的α溶素 (α-HL) 能够插到宿主细胞的细胞膜上，导致细胞营养物质流失而溶解。与通过电极对并使用膜片钳仪器驱动的纳米孔技术不同，自然界中的跨膜运输过程往往自发产生，且完全不需要冗余的电极和膜片钳等外围电子器件的辅助，是最简化的物质跨膜输运分子机器。

受此启发，我校化学化工学院生命分析化学国家重点实验室陈洪渊、黄硕课题组开发了一种新型的纳米孔检测方法，并将其命名为无电极纳米孔技术（DOP，DiffusiOptoPhysiology），也是世界首个无需电极的单分子纳米孔检测方法。该团队在纳米孔的两侧分别加入钙离子与钙离子荧光染料，在浓度梯度驱动下，钙离子自由扩散穿过纳米孔与荧光染料结合释放荧光信号，从而间接实现-纳米孔在液滴-凝胶界面双分子层上实时成像，并成功展示了其对小分子、高分子与生物大分子的单分子传感。这项技术充分简化了传统的纳米孔检测模型，去掉了电迁移项在物质传递中的贡献，仅由扩散、化学反应和流体三项来描述物质的传递。


通过进一步对电解质溶液与孔道优化，其传感性能可与传统的电生理纳米孔技术相当，而理论检测密度可高达104 pores/mm2。由于DOP无需预留电极空间，其测量体积可进一步减小到~30 pL，检测体积上是现有纳米孔技术的百万分之一，显著降低了样品消耗，非常适用于丰度极低的分析物测量。此外，不使用电极让研究者可以很轻松的构建微液滴DOP检测阵列。这种检测模式非常适用于多组分，平行化的高通量药物筛选，其理论检测密度可达103 bilayers/ mm2（图1）。在此基础上，该团队构建了高通量可抛弃式单分子分析芯片，该芯片仅需简单且无生物毒性的材料构成，现有芯片成本不足1美元，非常适用于临床检测中的可抛弃式检测需求，并有望进入日常生活。


该工作以“Electrode-free Nanopore Sensing by DiffusiOptoPhysiology”为题，于2019年9月6日在《Science Advances》发表相关论文（DOI: 10.1126/sciadv.aar3309，文章链接：https://advances.sciencemag.org/content/5/9/eaar3309）。我校化学化工学院直博生王玉琴为该论文第一作者。我校化学化工学院陈洪渊院士与黄硕教授为该论文共同通讯作者。此项研究得到了国家自然科学基金（项目编号：91753108、21327902、21675083）、中央高校基本科研业务费（国际科技合作促进项目）（项目编号： 020514380142、020514380174）、生命分析化学国家重点实验室（项目编号：5431ZZXM1804、5431ZZXM1902）、南京大学卓越计划 (项目编号:ZYJH004)、江苏省高层次创业创新人才引进计划和南京大学科技创新基金项目等经费支持。


纳米孔道单分子电化学技术是利用电化学空间限域,使得待测分子与纳米孔道界面分子基团发生相互作用,从而有效增强了对单个分子观测的时间分辨能力。通过测定单个分子穿过纳米孔道时产生的特征离子流阻断信号可实时获取单个分子的尺寸、结构及构象等信息。


黄硕，南京大学教授、博士生导师,2006年于南京大学物理系获得物理学学士学位；2011年于美国亚利桑那州立大学获得生物物理学博士学位； 导师是Stuart Lindsay教授；2011年至2014年在英国牛津大学从事博士后研究工作，导师是Hagan Bayley教授。 2015年7月应聘南京大学化学化工学院教授。现从事主要科研方向为具有仿生学概念的单分子纳米孔生物传感器的 新仪器，新技术的开发。以及基于纳米孔的单分子显微成像技术。其中在纳米孔单分子成像方面具有原创性技术， 具有国际前沿研发水平。目前已于国际权威期刊Nature Nanotechnology, Nano Letters, Journal of Physical Chemistry C, Nanotechnology, Review of Scientific Instrument发表论文9篇。总引用大于500次。 其中以第一作者发表Nature Nanotechnology 2篇，并入选2010年12月刊封面。已授权国际专利两项，并分别 转让Roche,OxfordNanopore Technologies等企业。


陈洪渊，1961年毕业于南京大学化学系。现为南京大学教授, 中国科学院院士（2001年当选）。1981-84年为联邦德国Mainz大学访问学者，其后曾分别获德国DFG、DAAD、VW-Stiftung等基金的资助多次以访问教授或客座教授进行中短期的合作研究。现任：南京大学教学委员会副主任、校学术委员会委员、院学术委员会主任、分析科学研究所所长，《生命分析化学国家重点实验室》（筹）学术委员会主任。现兼任：教育部科技委委员、化学化工学部主任，科技委学风建设委员会副主任；全国测试协会副会长；中国化学会常务理事、分析化学委员会副主任；江苏省化学化工学会理事长；江苏省质量协会副理事长；《 Science in China》、《中国科学 化学辑》、《高等学校化学学报》、《Chem. Res. in Chin. Univ.》四刊副主编；《化学进展》、《分析科学》、《色谱》等杂志的编委或顾问编委等；北京大学、清华大学、南开大学等兼职教授。历任：中国科学院化学学部常委；国家最高科学技术奖励委委员和评委；国家自然科学奖励委成员和评委；国家自然科学基金委、学部、学科评委；江苏省质量协会、学会副理事长；若干国家重点实验室学术委员会主任等。曾任《国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）》电化学委员会国家代表（1991-1994）。 长期从事电化学分析基础、仿生催化、生物电化学、化学生物学和微全分析系统等领域的研究，卓有成就。主持完成了国家、省部委和国际合作科研项目35项。目前主持国家自然基金重大项目和973纳米科技项目课题和与基金面上项目等。迄今已发表论文640余篇, H因子为46；专利7项；合编著译书6册，百科全书或专著4专章；《21世纪化学丛书》和《10000个科学难题（化学辑）》主编。曾获：国家自然科学二等奖（2007）、何梁何利科技进步奖（2006）、国家自然科学三等奖(1982)、全国科学大会奖(1978) 各1项，教育部自然科学一等奖（2001，2006）2项，国家教委（1998）与教育部(1999)科技进步三等奖各１项。2004年评为全国模范教师；2005年评为全国先进工作者，获全国“五、一”劳动奖章。