2019年国家自然科学奖项目提名-单分子相互作用的方法学研究和应单分子相互作用

zhetengwan

项目简介

研究分子间相互作用是分子科学领域的核心内容，是认识各种生化反应和生命过程的分子机制、研制新型材料与药物、以及发展疾病诊疗新技术的基础。由于分子间作用往往是一个在纳米尺度上的动态、可逆的弱相互作用过程，发展高时空分辨的单分子研究方法，揭示被系综研究平均化所掩盖的分子特性，是阐明分子间相互作用本质和规律的关键。本项目针对分子间相互作用研究中需解决的三个基本科学问题：即单对分子特异识别的作用力基础、多分子组装体系的分子协同作用机制和复杂生物体系的分子间动态相互作用规律，系统地发展了基于扫描探针显微镜及其与荧光显微成像联用的单分子分析表证新方法，取得系列重要成果。

1．建立了定量表征单对DNA/蛋白质相互作用强度的AFM单分子力谱法，揭示了核酸适体与靶蛋白特异识别的作用力基础。通过测定单对核酸适体和蛋白质分子间非共价键断键力，发现化学抗体核酸适体和靶蛋白相互作用力可强于天然抗体与靶蛋白相互作用力，为核酸适体作为新型分子识别探针在生化分析中的广泛应用提供了理论依据；在此基础上，发展了基于核酸适体的血清中疾病相关生物分子免标记检测新方法，促进了核酸适体分析化学的发展。

2.通过对分子组装体系中分子间协同相互作用的高分辨STM研究，提出了调控表界面功能分子形成可控均一组装结构的新方法。揭示了利用多氢键效应由非手性分子组装产生单一的表面手性及其手性传递、放大的分子机制，发现手性组装过程“多数原理”；通过调控动态共价键的热力学平衡及形成动力学过程，实现了稳定均一的二维分子纳米结构的构筑；在研究手性识别分离、纳米生物传感等方面具有重要意义。

3.发展了多参数表征活细胞中单分子动态相互作用的单分子荧光成像及其与AFM联用新技术，发现细胞膜上转化生长因子受体结构的动态变化、以及单体形成二聚体激活的信号转导新模式。提出了细胞之间通过膜纳米管进行电信号传导的新通讯方式，发现单壁碳纳米管通过直接穿过细胞壁，输运分子进入不同细胞器的新途径；为单分子水平研究信号转导和纳米生物效应提供了新策略。

上述成果推动了单分子显微成像在分析化学领域的发展，在揭示分子间相互作用的基本性质和规律、发展高灵敏生物分析方法等方面具有重要的科学和应用价值。项目8篇代表性论文发表在PNAS、Nat.Commun.、JACS、Anal. Chem.等权威刊物，他引1000多次，研究成果得到国内外同行的高度评价，如被认为“对教科书定义做了重要延伸”、“特别创新和有应用前景”，相关结果选入美国大学分析化学教材等。

四、客观评价

8篇代表性论文发表在PNAS、Nat.Commun.、,JACS、Anal. Chem.、Nano. Lett.、Cardiovasc. Res.等国际权威学术刊物，总他引1000多次，获授权国家发明专利8件。他引论文包括Science、Nat. Mater.、Nat. Rev. Drug. Discov.、PNAS、JACS、Angew.Chem. Int. Ed.等高影响期刊论文。相关引用和评价举例如下。

重要科学发现一：【代表性论文1】AFM测定核酸适体与靶蛋白间非共价键断键力的工作，被国际同行作为利用AFM单分子力谱研究DNA-DNA、蛋白-蛋白作用外的另一类DNA-配体和核酸适体-蛋白质相互作用的代表性工作，韩国系统生物动态学重点研究中心的Park教授认为这些工作表明“AFM正快速发展为单分子水平表征亲合力和识别特性的技术”。德国马普所Berger教授在其JACS论文中认为“AFM单分子力谱（AFS)可更定量地确定核酸适体结合蛋白质和细胞的断键力”。SPM研究领域国际知名专家丹麦科学院院士Besenbacher教授肯定了项目组的AFM测力方法，指出它使了解生物分子识别动力学过程成为可能。同时，国际同行将该结果作为核酸适体与靶分子具有与抗体-抗原类似甚至更强相互作用的依据，在发展多种基于核酸适体的分析方法和研究核酸适体识别性质时都进行了引述，本项目的工作推动了核酸适体分析化学的发展。

【代表性论文2和3】项目组利用核酸适体和靶标分子间稳定的相互作用，所建立的核酸适体免标记荧光检测法，受到国际同行广泛关注，这两个工作在Chem. Soc. Rev.，Chem. Rev.等权威期刊的综述中都有大幅正面评述；被评价为是“首次报道免标记DNA、RNA核酸适体用于均相溶液检测”，“方和白的工作成功地证明了免标记法对于检测DNA结合蛋白的可行性”。美国Standford大学冠名教授Kool在Chem. Soc. Rev.中评价该工作“对thrombin检测限优于大多数DNA核酸适体的方法”；美国伊利诺斯大学Lu教授在Chem. Rev.评论这两个工作的“最大优势是免标记，适合于RNA核酸适体”；美国Kansas大学杰出教授Wilson在其Anal. Chem的论文中多处引用和对照本项目组的工作，并认为是“特别创新和有应用前景的方法”；项目组这一研究方法和研究结果被选入美国大学常用的分析化学教材《Quantitative Chemical Analysis》。

重要发现二：【代表性论文4和5】项目组在功能分子的表面组装及调控方面的工作得到了国内外同行的广泛关注，Chem. Comm.副主编S. De Feyter，ACS Nano主编P. S. Weiss，J. Phys. Chem. Lett.高级主编F. Zaera等领域内专家多次在Chem. Soc. Rev.，Chem. Rev.等权威期刊中对项目组的工作进行正面评述，如F. Zaera教授强调项目组发展的手性诱导方法“具有手性记忆效应，在去掉手性种子后结构的手性特征依然可以保持”，De Feyter教授指出项目组的表面手性研究工作是“少数几个在对映体混合体系中实现了手性放大的工作之一”，P. S. Weiss教授及D. F. Perepichka教授在ACS Nano的综述中对项目组利用表面动态共价化学调节分子组装及反应的工作进行了原图引用，伦敦大学学院的Blunt等评价该工作是一项“突破性工作，使用固气界面反应的方法已经制备了多种亚胺键有机共价结构”，多个课题组将项目组提出的热力学平衡及生长动力学控制策略应用于不同类型的表面分子反应，实现了分子的表面反应的调控及大面积稳定有序分子纳米结构的构筑。

重要发现三：【代表性论文6】项目组发展的单分子荧光漂白台阶数分析方法，被认为是“研究膜蛋白亚基组成的有价值的方法”，不少国际同行将该方法应用到其他膜蛋白受体的研究，如德国Bielefeld大学Heilemann1教授“采用类似的单分子分析方法”研究了MET受体的组成。通过单分子成像项目组发现的转化生长因子单体二聚化激活新机制，瑞典Umea大学Landström教授评论：“长期以来人们认为TGF-β受体以二聚体的形式存在于细胞膜，张等近期通过对GFP标记的TGF-β受体单分子成像，证明TGF-βII型受体在配体刺激前以单体形式存在，随后又证明TGF-βI型受体也以单体形式存在，配体TGF-β刺激使得两种受体的二聚体增加”。这一新的机制被哈佛大学医学院Corey教授、转化生长因子信号通路研究领域权威以色列Tel Aviv大学Henis教授等发表的论文中广泛接受。

【代表性论文7】利用荧光成像与AFM联用技术发现单壁碳纳米管可进入完整植物细胞的工作，被Nat. Mater.，PNAS等权威期刊论文大量引用。美国Arkansas大学纳米中心Khodakovskaya教授指出“刘等早先提出并通过共聚焦显微成像证明了碳纳米管可穿过烟草细胞壁”。各国研究者随后在利用多壁碳纳米管、碳纳米管阵列、ZnO纳米颗粒、金纳米颗粒、富勒烯、C点等其他纳米材料或光声光热法等其他研究方法开展纳米材料与植物细胞相互作用研究时，都引用参考了项目组的该工作。

【代表性论文8】利用荧光成像与AFM联用技术，发现心肌细胞和成纤维细胞之间通过细胞膜纳米管进行钙信号传递的工作，不仅引起化学领域专家关注，还得到生物学家的高度重视。英国帝国理工大学国家心肺研究所Kohl教授认为是“心肌细胞和成纤维细胞之间存在膜纳米管连接的首个证据”，加拿大St. Boniface General医学研究中心心血管研究所Dixon教授对此发表了2页的当期评论介绍该发现的重要性，认为是“发现心肌细胞和成纤维细胞间通讯进程中的创新成果”，“对教科书上关于心肌细胞电信号连接的定义做了重要延伸”。美国加州大学戴维斯分校药理系Ripplinger教授也评述该工作提示了“细胞与细胞间电信号连接的另一种机制”。

鉴于项目所取得的重要成果，项目组主持的相关科技部国家纳米重大研究计划单分子单细胞纳米检测表征项目、国家杰出青年基金和中科院百人计划项目都曾被专家评为结题优秀，并主持“分子纳米结构与分子成像技术”科技部重点领域创新团队。

主要完成人情况：

第一完成人：方晓红，研究员，参与项目时间为2002-2013年，完成单位/工作单位为中科院化学所；本项目的负责人，提出本项目的研究方向和研究思路，项目中重要科学发现一和重要科学发现三的主要完成人：建立定量表征DNA/蛋白质相互作用的AFM单分子力谱法，实现核酸适体与靶标蛋白相互作用力的测定，建立基于核酸适体的免标记生化分析新方法；发展活细胞单分子荧光显微镜成像及其与AFM联用技术，提出膜蛋白信号转导、细胞通讯和纳米粒子细胞输运的新机制。代表性论文1、2、6、8共同通讯作者和代表性论文3、7的唯一通讯作者。

第二完成人：王栋，研究员，参与项目时间为2009-2013年，完成单位/工作单位为中科院化学所；本项目重要科学发现二的主要完成人，通过发展表征组装体中单分子相互作用的扫描隧道显微术，发现了非手性分子产生表面二维手性及其手性调控、放大的分子机制，以及调控动态共价键构筑稳定均一的二维分子纳米结构的方法。是代表性论文4、5的共同通讯作者。

第三完成人：白春礼，研究员，院士，参与项目时间为2002-2004年，完成单位为中科院化学所，现任中科院院长。本项目研究工作的开创人，在2002-2004年间对该项目做出重要的学术指导和学术贡献。重要科学发现一的共同完成人，建立了原子力显微镜单分子力谱技术，提出了基于DNA与蛋白高亲和力的蛋白质分析检测方法。是代表性论文1，2的共同通讯作者。

第四完成人：陈婷，副研究员，参与项目时间为2009-2013年，完成单位/工作单位为中科院化学所；本项目重要科学发现二的共同完成人，利用高分辨STM发现了表面手性组装体系中分子间特异性相互作用，发展了基于特异性氢键的组装手性诱导及控制方法，揭示了组装过程中手性传递及放大的分子机制。是代表性论文4的第一作者。