郑鹏课题组利用蛋白连接酶和切割酶可控的制备聚合蛋白质分子

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  将多个蛋白质分子交联构建成蛋白二聚体、三聚体甚至多聚体在生物技术、材料和制药等领域有着广泛的应用。以蛋白质为基质的生物材料，具有完美的生物相容性和功能多样性等优势。而在生物制药中，将蛋白类药物分子与其他分子或蛋白交联聚合也有着广泛的应用。目前聚合蛋白主要是利用巯基交联的方式，该反应聚合过程较难调控，因此得到的是聚合度不同的多聚蛋白混合物。其它利用蛋白连接酶的交联方式，也存在着连接效率低，聚合度不可控等问题。

图1. 通过联用蛋白连接酶OaAEP1和蛋白切割酶TEV，我们可以将蛋白质分子从单体逐步交联，分别得到蛋白质二聚体，三聚体，甚至十聚体。通过单分子力谱进行的蛋白质解折叠实验，也在单个分子的层次上证明了该多聚蛋白含有设计的分子个数和正常的结构稳定性，可用于复杂蛋白体系例如金属蛋白的多聚蛋白分子构建和表征。

    针对这些挑战，近日南京大学化学化工学院配位化学国家重点实验室郑鹏教授课题组通过一种高效的蛋白连接酶（oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases 1, OaAEP1）和一种经典的蛋白切割酶（(tobacco etch virus, TEV）的联用，成功的实现了多聚蛋白质分子的可控聚合。从蛋白质单体出发，可以依次分步合成二聚体、三聚体，甚至十聚体。体系中采用的蛋白酶在不同的pH和多种金属离子的存在下都具有较高的活性，能够广泛的应用到多种蛋白质体系中，特别是那些需要在单体层次上进行提存，含多个蛋白结构域分子量过大容易错误折叠，以及含金属离子的复杂蛋白质体系中。同时，该连接反应只需要分别在蛋白质的单体N端引入两个氨基酸GL和C端引入三个氨基酸NGL，就可以在二十分钟内迅速完成单步反应，新形成的连接体对蛋白质分子的结构和性质影响极小。而且得到的多聚蛋白可以简单高效表面固定化，为下游的表征和其他研究提供了便利。
    同时我们采用以原子力显微镜(atomic force microscopy, AFM)为仪器的单分子力谱技术（single-molecule force spectroscopy, SMFS）对得到的多聚蛋白质分子进行了表征。在单个分子的层次下，验证了的多聚蛋白内的每个单体都具有和天然单体一致的结构和力学稳定性，不受引入连接序列的影响。另一个方面，我们的方法也为单分子科学的研究提供了一种长度可控的多聚蛋白质样品方法和样品固定方法。
    该工作以“Enzymatic Biosynthesis and Immobilization of Polyprotein Verified at the Single-Molecule Level”为题发表在Nature Communications. 2019, DOI: 10.1038/s41467-019-10696-x上。我院直博三年级研究生邓逸冰同学为第一作者，硕士生吴韬为第二作者。郑鹏教授为唯一通讯作者，新加坡南洋理工大学助理教授吴彬也参与了该项研究。此研究得到了国家自然科学基金（21771103）、中央高校基本科研业务费（14380171）、江苏省双创计划和江苏省自然科学基金（BK20160639）和配位化学国家重点实验室等经费的支持。


郑鹏，2008年毕业于南京大学匡亚明荣誉学院化学方向获学士学位，2013年毕业于加拿大不列颠哥伦比亚大学(University of British Columbia)化学系，获博士学位(金属蛋白的单分子研究，导师 Dr. Hongbin Li)，2013-2015年在美国哈佛大学生物化学和分子医学系从事博士后研究（生物力学和细胞生物学的研究, 合作导师 Dr. Timothy Springer）, 2015年入选国家中组部“青年##计划”。现任南京大学化学化工学院, 配位化学国家重点实验室教授,博士生导师。